石蜡切片免疫组化步骤（抗体药物研发公司新手必读）

ningxueqin

　　1、脱水
　　(1)、65℃烤箱干烤30min。（具体时间视切片大小多少可调整，一般不要超过1h，否则容易脱片）
　　(2)、二甲苯Ⅰ中15min，之后二甲苯Ⅱ中15min。
　　(3)、在无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ，95%酒精，80%酒精，70%酒精中分别浸泡各5min。（2、3这两步都是跑缸的，实验室应该有专门的缸，直接放里面就行了）
　　(4)、双蒸水浸泡5min
　　2、微波修复抗原：将切片浸入pH6.0，0.01M枸橼酸修复液中（配制方法见步骤末尾），电炉或微波炉加热至92至98℃，持续15min（注意不要煮沸）。冷却后（不能人工降温，不能在冷却前将切片从热水中取出）进行下一步。
　　对于这一步，首先配制好抗原修复液（根据你的抗原在胞质还是胞核表达而不同，胞质的选用枸橼酸修复液，胞核的选用EDTA修复，EDTA在此暂不做详细说明），接着将双蒸水中浸泡后的切片放入修复液中，拿至微波炉加热修复，在此我仅述我们的修复过程以供参考。
　　抗体药物研发公司修复液盒子外面另外放一盛水的盒子，防止修复液沸腾蒸发，首先高火烤8分钟（具体时间视切片多少调整），发现修复液沸腾后立刻停止，如果未沸腾再继续延长烤时间，结束后等待1min，接着中火烤1min30s，停1分钟，再中火烤1min30s，停1分钟，如此循环共计30分钟，结束后将整个装有抗原修复液和切片的盒子摆到阴凉处自然晾干，晾干后再进行下一步。
　　3、室温下PBS洗涤5min×3次。（切片全部浸泡在玻璃缸中加入PBS液放入摇床，5min后取出倾去液体，重新加PBS，如此洗涤3次）
　　4、3%双氧水室温孵育15min，以内源性过氧化物酶的活性。
　　5、室温下PBS洗涤5min×3次。（见第3步说明）
　　6、封闭：滴加正常羊血清封闭液（A试剂），37℃孵育30min（具体时间长短视情况而定，时间太长可能导致特异性抗体也被封闭，做不出结果来）。甩去多余的液体，不冲洗。
　　7、滴加适当稀释的一抗(抗体用PBS稀释，具体稀释浓度见抗体说明书，一般刚开始做的时候多试验几个浓度，如1:50,1:100,1:150等，以寻找出效果好的抗体稀释浓度)，4℃过夜，我们一般是将切片摆到底下盛有水的湿盒中放入4℃冰箱过夜。（举例1:100稀释方法：99μL的PBS中加入1μL的抗体。）
　　第二天
　　8、取出昨天过夜的湿盒，37度复温30min，PBST冲洗5min×3次。
　　9、滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG（B试剂），37 ℃孵育30 min。
　　10、PBST冲洗5minX3次。
　　11、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液（C试剂），37 ℃孵育30 min。
　　12、PBST 冲洗，5min×3次。
　　13、DAB显色：滴加显色液，室温显色，镜下控制反应时间，一般在3至10min之间。反应至显微镜下可见棕褐色颗粒为止，蒸馏水终止反应，并用蒸馏水洗涤。显色前先准备好双蒸水，切片从显微镜上拿下来后直接入水中。
　　14、苏木素复染。4min后流水冲洗。（苏木素复染时间一般3min即可，视具体情况而定）
　　15、分化：1%盐酸酒精（实验室有专门的缸，不用自备）中浸泡，之后流水冲洗。（分化时间一般为1-2s，即将切片迅速浸入盐酸酒精中后迅速提起）
　　16、蓝化：氨水中浸泡30s~1min，之后流水冲洗。我们的蓝化直接是将切片浸入水中浸泡10min就可以了。
　　17、脱水：分别在70%酒精、80%酒精、95%酒精、无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ各3min。（这些实验室有专门的缸，不用自备）
　　18、透明：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中浸泡各10min，晾干。（同上）
　　19、中性树脂封片，显微镜观察。（封片可干封也可湿封，湿封即浸泡完二甲苯Ⅱ之后不晾干，切片从二甲苯中捞出后迅速滴加树脂盖上盖玻片）
　　各种液体配制方法：
　　抗原修复液中涉及到的液体：
　　A液——枸橼酸（柠檬酸）5.2525g+双蒸水250ML（易长毛，长毛后需重配）
　　B液——枸橼酸钠（柠檬酸钠）14.705g+双蒸水500ML
　　抗原修复液——A液4.5ML+B液20.5ML+双蒸水225ML
　　3%双氧水——90ML双蒸水+30%双氧水10ML
　　PBS——磷酸氢二钠14.5g+氯化钠40g+□□1g+磷酸二氢钾1g+双蒸水5L
　　PBST——PBS 2L+（Tween-20） 1ML
　　DAB显色剂（配制时请关灯避光）——1ML双蒸馏水加入DAB显色试剂盒中的A液一滴后混匀，再加入B液、C液各一滴混匀即刻，避光保存，30min内使用。