CDMO企业平台PCR 反应特异性提高方法

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　　CDMO企业平台PCR 反应特异性提高方法：
　　1. 引物的设计
　　引物最好在模板 cDNA 的保守区设计，长度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超过连续三个 G 或 C，碱基分
　　布错落有致，避免引物自身形成二聚体，设计完成之后，需进行 BLAST 检测，如果与其他基因不具有互补性，则可以进行下一步实验。
　　2. 降落 PCR
　　降落 PCR 是一种简单的降低非特异性产物的 PCR，最大的优点就是可以降低实验耗时，同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度，退火温度过高会使 PCR 效率过低，过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落 PCR 提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高 PCR 的特异性和效率。
　　3. 热启动扩增
　　采用热启动方法进行扩增，是除了设计最佳引物之外，提高 PCR 反应特异性最好的方式。在一般的 PCR 反应中，试剂的配置需在冰上进行，且要将 PCR 仪预热，这种方法就类似于热启动，能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性，只要体系中有 DNA 链存在，就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用热启动 Taq 酶（或热启动高保真聚合酶）去扩增，它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心，当温度上升到 95℃时恢复活性，指导扩增。
　　4. 巢式 PCR
　　采用巢式 PCR 进行扩增，在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通 PCR 不同的是，它采用两对引物进行扩增，首先用第一对引物普通 PCR，然后将第一轮扩增的产物稀释 100 倍后用第二对引物（巢式引物）二次扩增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度，合适的琼脂糖凝胶的浓度。