抗体药物研发流程图类器官RNA和蛋白提取方法

大海的鱼

　　很多老师咨询类器官RNA和蛋白如何提取,其实类器官可以按微小组织进行RNA和蛋白提取,今天小爱给大家讲一讲提取方法.
　　抗体药物研发流程图类器官蛋白提取方法
　　一、试剂准备(细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒(abs9346))
　　1、准备溶液
　　1)室温融解试剂盒中的各种溶液,溶解后除结构蛋白提取液外,其他试剂立即置于冰上;
　　2)结构蛋白提取液溶解后,可放置于37℃水浴中温浴至透明后,常温放置.
　　2、蛋白提取工作液的准备
　　1)胞浆蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;
　　2)胞核蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;
　　3)膜蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;
　　4)结构蛋白提取工作液的制备:临用前,根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF.
　　二、类器官收集及洗涤
　　1、类器官收集
　　移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730),轻柔吹打基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组),4℃静置10min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化),300g ,4℃, 离心5min弃上清.
　　2、类器官清洗
　　添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬,300g ,4℃,离心5min弃上清.
　　三、类器官蛋白提取
　　1、胞浆蛋白提取
　　1)向含类器官沉淀的EP中加入2mL的胞浆蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡20min;
　　2)准备1-5mL的注射器,用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次,在4℃条件下,15000g离心10min.取上清液存于EP管中,即为胞浆蛋白.
　　2、胞核蛋白的提取
　　取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4mL冰浴的胞浆蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,弃去上清液,沉淀物中加入1mL冰冻的胞核蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,上清液为细胞核蛋白,转入EP管并保存.
　　3、胞膜蛋白的提取
　　在步骤3.2中的沉淀物中加入1mL冰冻的膜蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,上清液为细胞膜蛋白,转入EP管并保存.
　　4、结构蛋白的提取
　　在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5mL,4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,保存上清液即为细胞骨架蛋白.
　　5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃,可以用于Western,EMSA,footprinting,报告基因检测以及酶活力测定等后续操作.
　　更多实验注意事项 细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒　产品说明书 (absin.cn)